На протяжении почти столетия среди ученых превалировало мнение, что полость матки стерильна в нормальных условиях. Считалось, что эта стерильность поддерживается системой эндоцервикса и шеечной слизи, которые обеспечивают непроницаемый барьер против проникновения бактерий из влагалища. Однако эта гипотеза опровергнута, и недавние исследования показали, что микроорганизмы обнаруживаются даже на эндометрии здоровых женщин.
В полости матки пациенток с хроническим эндометритом (ХЭ) встречаются такие бактерии как Streptococcus spp., Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus spp., Corynebacterium и Mycoplasma/Ureaplasma spp. Микробиологический анализ выявил E. faecalis, которая в литературе описывается как один из наиболее частых этиологических факторов ХЭ [2].

Поддержание стабильности вагинального микробиома определяется двумя основными факторами: состоянием микрофлоры и состоянием иммунной системы слизистой оболочки влагалища. Изменение состава микробиоты влагалища, сопровождающееся чрезмерным размножением УПМ, приводит к изменению профиля экспрессируемых мРНК цитокинов. Применение теста, основанного на ОТ-ПЦР для оценки локальной воспалительной реакции, имеющего высокие показатели чувствительности и специфичности (100 % и 87,5 % соответственно), представляется наиболее информативным подходом.

Показано, что содержание цитокинов в различных биологических жидкостях человека может быть связано с разными патологическими состояниями. Повышение концентрации IL-2 наряду со снижением концентрации IFN-γ в цервикальном секрете. Выявленное снижение экспрессии IFN-γ может свидетельствовать об угнетении местной иммунной реакции у пациенток с осложненным течением воспалительного процесса, что приводит к увеличению концентрации IL-2 в цервикальном секрете и крови как индуктора Т-хелперов, усиливающего секрецию IFN-γ [1].

Инфекции матки увеличивают экспрессию транскриптов мРНК в эндометрии, которые кодируют молекулы, связанные с воспалением, такие как цитокины IL-1β и IL-6 и хемокин IL-8 [3].

Концентрации TNF-α, IL-6 и IL-10 были выше (P <0,05) у коров с клиническим эндометритом, чем у коров с субклиническим эндометритом и у здоровых контрольных животных, тогда как концентрации IL-8 как у коров с клиническим, так и с субклиническим эндометритом были выше (P <0,005), чем в контроле. Не было выявлено значительного влияния группы, времени отбора проб или взаимодействия на концентрацию цитокинов в сыворотке. В заключение, коровы с эндометритом имеют более высокие концентрации воспалительных цитокинов в маточном приливе, чем здоровые коровы, но никаких различий в сыворотке не наблюдалось [4].

Цель исследования: установить взаимосвязь между микробиомом цервикального канала у коров и экспрессией генов локального воспаления при скрытых формах ВЗОМТ.

Задачи:

1. Изучить микробиом цервикального канала у коров при скрытых формах ВЗОМТ.
2. Изучить транскриптомы генов локального воспаления цервикального канала при скрытых формах ВЗОМТ.

Материалы и методы исследования. В исследование отбирались животные после второго-третьего отела с неуспешными попытками искусственного осеменения и предположительным диагнозом скрытый эндометрит. В исследование не отбирались животные с выраженным воспалением и гнойными истечениями в связи с отсутствием необходимости применения диагностических лабораторных методик.

Отбор проб производили стерильным ватным тампоном с цервикального канала и доставляли в лабораторию для исследования.

Готовили последовательные 10-кратные разведения от 101 до 1010. Разведения по 0,1 мл засевали на сектора следующих пластинчатых сред: мясо-пептонный агар с добавлением 5 % эритроцитов барана, Эндо, Плоскирева, желточно-молочно-солевой агар, Энтерококкагар, Сабуро. Одновременно проводили посевы на жидкие, разлитые высоким столбиком в пробирки, среды: Бликфельдта и Бифидумсреду, сахарный бульон. Посевы выращивают при 37 °С в течение 24–72 часов (на Сабуро температура 24 °С – 5 суток).

Для определения локальной воспалительной реакции выделяли нуклеиновые кислоты с применением набора «РНК-Экстран». После выделения РНК проводили реакцию обратной транскрипции для получения матрицы мРНК, комплементарной ДНК, которая в дальнейшем амплифицировалась методом ПЦР. В качестве праймеров для обратной транскрипции использовали нуклеотидную последовательность, подобранные посредством компьютерных программ (таблица 1).

Таблица 1.

Праймеры для проведения обратной транскрипции генов локального ВЗОМТ

Реакцию проводили при температуре 40 ºС в течение 30 минут с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95 ºС в течение 5 минут. Визуализацию ПЦР-продукта осуществляли методом гель-электрофореза.

Собственные исследования. При исследовании цервикального канала коров установлено, что бифидобактерии обнаруживаются в количестве 101 в 7 пробах, 102 – в 2 пробах, 103 – в 5 пробах; лактобактерии в количестве 101 не обнаружились, 102 – в 4 пробах, 103 – в 2 пробах, 104 – в 1 пробе; микроорганизмы семейства Bacillus spp. культивируются в разведении 101 в 4 пробах, в разведении 102 в 1 пробе; E. coli без гемолитических свойств культивировалась в 1 пробе в разведении 102. Также установлено наличие кокковой грамположительной микрофлоры: микроорганизмы семейства Staphylococcus spp. с выраженными гемолитическими свойствами обнаруживались в 1 пробе в разведении 102; E. faecalis с гемолитическими свойствами обнаруживался в 2 пробах в разведениях 101 и 102; E. faecium с гемолитическими свойствами – в 1 пробе в разведении 101 (рисунок 1).

Удельный вес микроорганизмов в пробах составляет: бифидобактерии – 30 % проб; лактобактерии – 12 % проб; Bacillus spp. – в 5 % проб; E. coli – в 5 % проб; микроорганизмы семейства Staphylococcus spp. – в 4 % проб; E. faecalis – в 7 % проб; E. faecium – в 4 % проб; УПМ не обнаружено в 33 % проб (рисунок 2).

При анализе экспрессии генов воспаления установлено наличие мРНК цитокинов воспаления IL-8 в 45 % проб, IL-6 в 10 % проб. Во всех пробах с наличием условно-патогенных микроорганизмов присутствуют мРНК цитокинов воспаления. В двух пробах с вагинитами (покраснение, отечность) установлено наличие мРНК IL-6 (таблица 2).

Таблица 2.

Микробиом и наличие мРНК генов воспаления цервикального канала при ВЗОМТ коров

Выводы:

1. Изменение в количественном и качественном составе молочнокислых микроорганизмов не является показателем ВЗОМТ у коров.
2. Количество нормальной микрофлоры репродуктивного тракта коров не превышает количества 104.
3. УПМ представлена микроорганизмами: Bacillus spp.; Staphylococcus spp.; E. coli; E. faecium; E. faecalis.
4. При наличии УПМ рода Bacillus spp.; Staphylococcus spp.; E. coli; E. faecium; E. faecalis в цервикальном канале присутствуют мРНК цитокинов воспаления IL-8, IL-6.
5. При наличии клинических проявлений воспаления установлено наличие IL-8, IL-6. При субклинических формах ВЗОМТ присутствует только мРНК IL-8.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ:

При диагностике субклинических форм ВЗОМТ у коров определение транскриптома генов воспаления является информативным, специфичным и чувствительным подходом.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Плахова К. И. и др. Иммунные предикторы осложнений урогенитальной хламидийной инфекции, приводящих к нарушениям репродуктивной функции //Вестник дерматологии и венерологии. – 2012. – №. 4. – С. 41–47.
2. Радзинский В. Е. и др. Вклад хронического эндометрита в нарушения репродуктивной системы у пациенток с повторными неудачами имплантации //Гинекология. – 2021. – Т. 23. – №. 1. – С. 102–106.
3. Kasimanickam R. K. et al. Associations among serum pro-and anti-inflammatory cytokines, metabolic mediators, body condition, and uterine disease in postpartum dairy cows //Reproductive Biology and Endocrinology. – 2013. – Т. 11. – №. 1. – С. 1–13.
4. Kim I. H. et al. Inflammatory cytokine concentrations in uterine flush and serum samples from dairy cows with clinical or subclinical endometritis //Theriogenology. – 2014. – Т. 82. – №. 3. – С. 427– 432.

Автор: АНАСТАСИЯ СЕРГЕЕВНА МЕТЛЕВА, кандидат ветеринарных наук, доцент
Кузбасская ГСХА, e-mail: zveryski@mail.ru, тел. +7 (951) 592-49-57