Здоровье кишечника имеет большое значение для общего состояния здоровья свиней, включая пищеварение и всасывание питательных веществ, секрецию муцинов и иммуноглобулинов, а также селективную барьерную защиту от вредных антигенов и патогенов. Как и у других животных с однокамерным желудком, ЖКТ свиньи содержит несколько сотен видов микробов, переваривает и поглощает подавляющее большинство питательных веществ (Choct, 2009). Таким образом, как ткань стенки ЖКТ, так и микробиота просвета играют важную роль в поддержании здорового кишечника и его функций.

Накопленные данные показали, что микробиота кишечника играет ключевую роль в поддержании физиологического гомеостаза хозяина, в содействии развитию иммунной системы и в регулировании метаболизма хозяина (Kim et al., 2012). Микробиота кишечника регулирует метаболизм глюколипидов, аминокислот (Zhang et al., 2020), витаминов, желчных кислот и других питательных веществ (Pathak et al., 2020).

Здоровый кишечник является основой для производства свиней. В связи с этим поддержание или улучшение здоровья кишечника имеет важное значение не только для благополучия животных, но и для рентабельности свиноводства. Так, в слепой кишке свиней в результате ферментации микроорганизмами компонентов кормов (клетчатки, крахмала и пр.) образуется до 1,8 мэкв/л летучих жирных кислот (ЛЖК), что обеспечивает до 23 % необходимой организму-хозяину энергии. Обеспечение свиней белком происходит также при участии микроорганизмов (Тараканов, 2006).

Исследование микробиома свиней представляет собой актуальную проблему, поскольку, по мнению ряда ученых, благодаря строению пищеварительной системы свиньи хорошо адаптированы к усвоению растительных и животных кормов, при этом метаболическая активность их микрофлоры сопоставима со жвачными животными, и обеспечение свиней белком происходит также при участии микроорганизмов.

Наиболее информативными являются молекулярно-генетические методы, в первую очередь, направленные на анализ не отдельных его членов, а структуры сообщества в целом – такие как NGS-секвенирование (Peng et al, 2013). Высокая разрешающая способность с возможностью одновременного анализа сразу нескольких тысяч последовательностей ДНК микроорганизмов с использованием метода NGS-секвенирование (next generation sequencing) позволяют получить достоверную информацию обо всех изменениях сотен видов микроорганизмов кишечника, происходящих под действием определенных факторов (Diaz-Sanchez et al., 2013). В отличие от ПЦР-методик, данный метод позволяет проводить более глубокий анализ микробиомов и оценивать их изменения. Так, он позволяет различать виды патогенных бактерий Staphylococcus sp., Сlostridium sp., Campylobacter sp., Mycoplasma sp. даже в небольших количествах, что является крайне важным для использования данного метода в диагностических целях. Это огромное преимущество по сравнению с используемыми культуральными методами, поскольку известно, что большинство микроорганизмов не может быть легко культивировано на питательных средах. Использование современных молекулярно-биологических методов исследований открывает наиболее эффективный и надежный подход к изучению состава микробиоты кишечника, прежде всего, анаэробных и некультивируемых форм.

Молекулярно-генетической лабораторией ООО «БИОТРОФ» впервые были выполнены уникальные мониторинговые исследования биоразнообразия микробных сообществ кишечника свиней. В результате выполненных исследований накоплен ряд совершенно новых сведений о составе микрофлоры кишечника свиней. Это позволило расширить имеющиеся сведения и по-новому взглянуть на структуру и функции микробиомов свиней по сравнению с существующими представлениями.

Материалы и методы

Мониторинговые исследования микробиомов свиней проводили в условиях промышленных свиноводческих предприятий. Объектами исследования от свиней служили образцы содержимого различных отделов кишечника (n = 820), в т. ч. от поросят сосунов (n = 49), поросят-отъемышей (n = 36), поросят групп доращивания (n = 85), свиноматок (n = 54) и др. Образцы содержимого кишечника отбирали при убое, кала – из прямой кишки прижизненно. Объектами исследования были особи породы крупная белая из различных свиноводческих предприятий. Содержание и кормление животных осуществляли с соблюдением всех технологических показателей при равноценных составах комбикормов, соответствующих нормам для породы и возраста. Кормление и содержание животных осуществлялось согласно принятому на предприятии рациону, с соблюдением всех технологических параметров.

Отбор содержимого кишечника свиней (1–3 г) проводили с соблюдением условий асептики. Материал отбирался непосредственно после убоя. Отобранный материал помещали в стерильные пластиковые или стеклянные пробирки. Хранение проб содержимого до проведения анализа осуществлялось при температуре –20 °С.

Тотальную ДНК из образцов выделяли с помощью набора Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, США), предназначенного для экстракции ДНК из широкого спектра источников. NGS-секвенирование применяли для определения состава бактериального сообщества в образцах. Метод проводили на платформе для секвенирования следующего поколения MiSeq (Illumina, США) с применением праймеров для V3-V4 региона 16S рРНК согласно с рекомендациями производителя. Для приготовления библиотек использовали реагенты Nextera® XT IndexKit (Illumina, США), для очистки ПЦР-продуктов – Agencourt AMPure XP (Illumina, США), для проведения секвенирования MiSeq® ReagentKit v2 (500 cycle) (Illumina, США).

Обработку полученных ридов, включающую перекрывание, фильтрацию по качеству (Q30), триммирование праймеров, проводили с помощью биоинформатической платформы Illumina (Illumina, США). Контроль качества, оценка таксономического состава бактерий проводились в программе QIIME2 ver.2019.10 с использованием базы данных GreenGenes версии 13.5.

Результаты и обсуждение

Современные методы анализа микробных сообществ позволяют проводить уникальные исследования, основанные на анализе генов микроорганизмов, и получать наиболее полные данные о составе микробиомов. В результате проведения молекулярно генетической лабораторией ООО «БИОТРОФ» мониторингового исследования кишечника 800 свиней в различные периоды онтогенеза из ряда промышленных хозяйств с использованием молекулярно-генетических подходов впервые были получены новые сведения о составе микробиома ЖКТ здоровых свиней. Согласно результатам NGS-секвенирования доля лакто- и бифидобактерий, обладающих иммуномодулирующей и антимикробной активностью, в большинстве случаев не превышает 3 %. Основную же долю (до 50–85 %) микробиоты толстого отдела кишечника взрослых свиней составляют бактерии, участвующие в ферментации растительных полисахаридов, в частности, семейств Clostridiaceae, Flavobacteriaceae, Prevotellaceae, Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Eubacteriaceae и др. Широкое таксономическое разнообразие целлюлозолитических микроорганизмов в кишечнике свиней может быть связано с особенностями их питания, связанным с целым спектром разнообразных источников растительных полисахаридов в рационах.

Также существенную долю микробного сообщества кишечника взрослых свиней составляют бактерии класса Negativicutes, в частности, родов Megasphaera, Selenomonas, Veillonella. Особенностью метаболизма данных микроорганизмов является ферментация значительного количества летучих жирных кислот (ЛЖК): уксусной, пропионовой, масляной, валериановой и изовалериановой. ЛЖК, полученные в процессе микробиологического брожения, всасываются и используются как источник энергии на пролиферацию клеток обновляющейся слизистой кишечника, покрывают большой процент энергопотребности макроорганизма, масляная кислота восстанавливает функции поврежденных клеток печени. Кроме того, образованные ЛЖК обладают значительной антимикробной активностью в отношении патогенов желудочно-кишечного тракта.

Некультивируемые на питательных средах бактероиды порядка Bacteroidales всё чаще признаются численно преобладающим представителем кишечной микробиоты свиней, однако характер их взаимодействия с хозяином до конца не раскрыт. Преимущественно они представлены труднокультивируемыми облигатными анаэробами. На примере различных животных и человека показано, что данные микроорганизмы могут быть как комменсалами, так и патогенами. С одной стороны, известно, что они выполняют роль симбионтов в ЖКТ человека, животных и птиц, метаболизируя углеводы, в том числе крахмал, до ацетата, сукцината и изовалерата. При этом неоднократно отмечалось, что некоторые представители данного таксона, например, Bacteroides fragilis, нередко являются преобладающими микроорганизмами при полимикробных инфекциях. При этом синтез β-лактамазы некоторыми из них способствует повышенной антибиотикорезистентности к β-лактамным антибиотикам. Так, например, бактериемии, вызываемые B. Fragilis, связаны с 27 % смертности людей. У многих бактерий порядка Bacteroidales (Ormerod et al., 2016) обнаружен гомолог SpeB, пептидаза, способная расщеплять множество иммунологически релевантных белков. Так, у пародонтального патогена Prevotella intermedia, имеется гомолог interpain A, который принимает участие в ингибировании иммунного ответа посредством деградации комплемента (Potempa et al., 2009).

Помимо этого, в кишечнике клинически здоровых особей обширно представлены условно-патогенные и патогенные таксоны бактерий, такие как представители семейства Enterobacteriaceae, Clostridium perfringens, Staphylococcus, Campylobacter coli, Campylobacter gracilis, Staphylococcus capitis и др. Условно-патогенные бактерии, такие как Campylobacter gracilis и Staphylococcus capitis, также нередко являются сопутствующей микрофлорой, усугубляющей течение заболеваний.

Несмотря на то, что Campylobacter spp. обитает в пищеварительном тракте 38–63 % свиней, инфекции, возникающие в результате употребления в пищу свинины, встречаются редко (0,4 % всех подтвержденных случаев кампилобактериоза (Newell et al., 2016). Вместе с тем свиньи считаются основным резервуаром Campylobacter coli (90 % штаммов, выделенных от свиней), в отличие от других известных групп животных, которые в основном инфицированы Campylobacter jejuni (Qin et al., 2011). С другой стороны, данный вид не устойчив к замораживанию и высыханию. По этой причине, несмотря на высокую долю зараженных C. coli свиней на бойнях, возбудитель редко выделяется из свиных туш. Бактерии рода Campylobacter выделяют из различных продуктов из свинины. Источником кампилобактериоза также может быть свиная кость (например, корейка) и субпродукты (печень, сердце, почки и кишки) (Von Altrock et al., 2013).

C. perfringens чаще вызывает энтерит у новорожденных животных, таких как телята, овцы, козы и особенно свиньи. Заболевание свиней встречается во всём мире и представляет собой экономически важную проблему, поскольку может привести к смертности пораженных поросят до 100 % (Songer et al., 2005).

Интересно, что в толстом отделе кишечника выявлялись такие патогенные формы как Fusobacterium necrophorum и Staphylococcus aureus. Fusobacterium necrophorum, ответственная за возникновение некробактериоза свиней – инфекционной болезни, характеризующейся развитием гнойно-некротического стоматита, ринита, энтерита, дерматита, некроза кожи хвоста, ушей и конечностей. Бактерии рода Fusobacterium распространены в желудочно-кишечном тракте человека и животных (De Witte et al., 2017). Есть сведения, что они могут быть более многочисленными в профиле микробиома животных, содержащихся в неволе, чем у диких пород, в первую очередь исследователи связывают это с составом кормов (Wang et al., 2016).

Хотя часто фузобактерии являются нормальными составляющими ротоглоточной, желудочно-кишечной и генитальной микробиоты, они являются второй наиболее часто выделяемой анаэробной микробной группой из клинических образцов как человеческого, так и животного происхождения, особенно при гнойно-некротических инфекциях. Учитывая их разнообразную природу, это может являться следствием неоцененности истинной частоты встречаемости фузобактерий в кишечном микробиоме (De Witte et al., 2017).

Бактериальные заболевания животного происхождения, например, вызванные Campylobactersp., Salmonella sp., Listeria sp. или  семейством Enterobacteriaceae, представляют серьезную опасность для здоровья человека.

Заключение

В результате проведенных мониторинговых исследований было продемонстрировано, что основную долю (до 50–85 %) микробиоты толстого отдела кишечника взрослых свиней составляют бактерии, участвующие в ферментации растительных полисахаридов, в частности семейств Clostridiaceae, Flavobacteriaceae, Prevotellaceae, Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Eubacteriaceae и др. В кишечнике клинически здоровых особей обширно представлены условно-патогенные и патогенные таксоны бактерий семейств Enterobacteriaceae рода Staphylococcus видов Clostridium perfringens, Campylobacter coli, Campylobacter gracilis, Staphylococcus capitis. Таким образом, очевидно, что основную роль в поддержании здоровья пищеварительной системы свиней играет баланс положительной микробиоты, способствующий протеканию нормальных пищеварительных процессов в кишечнике.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Тараканов Б. В. Методы исследования микрофлоры пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и птицы. М.: «Научный мир», 2006. – 188 С.
2. Choct M. Managing gut health through nutrition. Br Poult Sci. (2009) 50:9–15. 10.1080/00071660802538632
3. Diaz-Sanchez S., Hanning I., Pendleton S., DʹSouza D. Next-generation sequencing: the future of molecular genetics in poultry production and food safety // Poult Sci. 2013. V. 92. P. 562–572.
4. Kim H. B., Borewicz K., White B. A., Singer R. S., Sreevatsan S., Tu Z. J. Microbial shifts in the swine distal gut in response to the treatment with antimicrobial growth promoter tylosin. Proc Natl Acad Sci. 2012; 109:15484–15490.
5. Newell D. G., Mughini-Gras L., Kalupahana R., Wagenaar J. A. Campylobacter Epidemiology — Sources and Routes of Transmission for Human Infection. In: Klein G., editor. Campylobacter: Features, Detection, and Prevention of Foodborne Disease. Academic Press; London, UK: San Diego, CA, USA: 2016. pp. 85–110.
6. Ormerod KL, Wood DL, Lachner N, Gellatly SL, Daly JN, Parsons JD, Dal’Molin CG, Palfreyman RW, Nielsen LK, Cooper MA, Morrison M, Hansbro PM, Hugenholtz P. Genomic characterization of the uncultured Bacteroidales family S24–7 inhabiting the guts of homeothermic animals. Microbiome. 2016; 4:36.
7. Pathak S. K., Xiang Y., Huang M., Huang T., Cao X., Liu H. Fused tetracyclic tris [1, 2 ,4] triazolo [1, 3, 5] triazine as a novel rigid electron acceptor for efficient thermally activated delayed fluorescence emitters. RSC Adv. 2020; 10:15529.
8. Peng, Y. Microbial diversity in uterus of healthy and metritic postpartum Holstein dairy cows / Y. Peng, Y. Wang, S. Hang et. al. // Folia Microbiol. – 2013. – Vol. 58. – P.593–600.
9. Potempa M, Potempa J, Kantyka T, Nguyen KA, Wawrzonek K, Manandhar SP, Popadiak K, Riesbeck K, Eick S, Blom AM. Interpain A, a cysteine proteinase from Prevotella intermedia, inhibits complement by degrading complement factor C3. PLoS Pathog. 2009;5:e1000316.
10. Qin S.-S., Wu C.-M., Jeon B., Shen Z.-Q., Wang Y., Zhnag Q., Shen J.-Z. Antimicrobial resistance in Campylobacter coli isolated from pigs in two provinces of China. Int. J. Food Microbiol. 2011; 146: 94–98. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro. 2011.01.035.
11. Songer JG, et al. Clostridial enteric infections in pigs. J Vet Diagn Invest 2005; 17:528–536.
12. Von Altrock A., Hamedy A., Merle R., Waldmann K.H. Campylobacter spp. – Prevalence on pig livers and antimicrobial susceptibility. Prev. Vet. Med. 2013; 109:152–157. doi: 10.1016/j.prevetmed. 2012.09.010.
13. De Witte C., Flahou B., Ducatelle R., Smet A., De Bruyne E., Cnockaert M., Taminiau B., Daube G., Vandamme P., Haesebrouck F., Detection, isolation and characterization of Fusobacterium gastrosuis sp. nov. colonizing the stomach of pigs, Systematic and Applied Microbiology, Volume 40, Issue 1, 2017, Pages 42–50, doi.org/10.1016/j.syapm. 2016.10.001.
14. Wang W., Cao J., Li J. R., Yang F., Li Z., Li L. X. Comparative analysis of the gastrointestinal microbial communities of bar-headed goose (Anser indicus) in different breeding patterns by high-throughput sequencing Microbiol. Res., 182 (2016), pp. 59–67, 10.1016/j.micres. 2015.10.003
15. Zhang L., Yue Y., Shi M., Tian M., Ji J., Liao X. Dietary Luffa cylindrica (L.) Roem promotes branchedchain amino acid catabolism in the circulation system via gut microbiota in diet-induced obese mice. Food Chem. 2020:126–648.

Авторы: АНДРЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ ДУБРОВИН, ЛАРИСА АЛЕКСАНДРОВНА ИЛЬИНА, ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА ЙЫЛДЫРЫМ, ЕКАТЕРИНА СЕРГЕЕВНА ПОНОМАРЕВА, ВАЛЕНТИНА АНАТОЛЬЕВНА ФИЛИППОВА
ООО «БИОТРОФ», Санкт-Петербург, г. Пушкин, ул. Малиновская, 8