Свиноводство является важнейшей отраслью животноводства и устойчиво развивается в странах с рыночной экономикой. Общий объем производства мяса в России в 2020 г. составил 11 млн тонн в убойном весе. Объем производства свинины составил 37,1 %, это второе место после производства мяса птицы [3].
На свиноводческую отрасль большое влияние оказывают инфекционные заболевания, из которых первостепенное значение имеет африканская чума свиней (АЧС). По данным ИАЦ Россельхознадзора, в России в период с 2007 по 2022 годы нотифицировано 2106 вспышек АЧС, из которых 1261 вспышка среди домашних свиней и 845 вспышек среди диких кабанов [4].

Африканская чума свиней (АЧС) – контагиозная, склонная к природной очаговости, остро протекающая септическая болезнь свиней, характеризующаяся лихорадкой, признаками токсикоза, геморрагическим диатезом и высокой летальностью [2].

Для своевременного принятия мер по ликвидации очага болезни, предотвращению ее распространения, а также для дифференциальной диагностики от других инфекций со схожими клиническими признаками, таких как классическая чума свиней (КЧС), репродуктивно-респираторный синдром (РРСС), синдром дерматита и нефропатии поросят (вызывается цирковирусом свиней 2 и 3 типов – ЦВС-2 и ЦВС-3), необходима быстрая, надежная, чувствительная и специфическая диагностика АЧС [1, 5]

Целью данной работы являлась разработка комплексного решения для молекулярной диагностики АЧС, КЧС, цирковирусных инфекций и РРСС. Для выполнения цели были поставлены задачи по разработке наборов для экстракции нуклеиновых кислот, а также наборов для выявления геномов перечисленных выше возбудителей методами ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме «реального времени» («АмплиПрайм® АЧС», «АмплиПрайм® ЦВС-2/ЦВС-3», «АмплиПрайм® КЧС», и «АмплиПрайм® РРСС»).

Материалы и методы

В работе использованы образцы патологического материала от свиней, естественно инфицированных вирусами АЧС (пробы селезенки), ЦВС-2 и ЦВС-3 (стабилизированная кровь, пробы внутренних органов), КЧС (пробы внутренних органов, культуральный вируссодержащий материал), РРСС (сыворотки крови), трансмиссивного гастроэнтерита свиней (фекалии), эпизоотической диареи свиней (фекалии), болезни Ауески (культуральный вируссодержащий материал из рабочей коллекции микроорганизмов ФГБУ ЦНМВЛ (г. Москва), антиген парвовируса свиней из набора препаратов для серодиагностики парвовирусной инфекции свиней в реакции торможения гемагглютинации (ФГБУ «ВНИИЗЖ»). Также использованы образцы ДНК вирусов АЧС (штамм «Ставрополь 01/08»), КЧС («ЛК-ВНИИВВиМ»), предоставленные ФГБНУ ФИЦВиМ (поселок Вольгинский).

Анализ нуклеотидных последовательностей генов вирусов АЧС, КЧС, ЦВС-2, ЦВС-3 и РРСС депонированных в базе данных генетической информации GenBank, а также расчет первичных структур олигонуклеотидных праймеров и зондов для ПЦР в режиме «реального времени» проводили с помощью программ BioEdit 7.0 и Oligo 6.0.

Для экстракции нуклеиновых кислот использовали наборы реагентов «МагноПрайм ВЕТ» и «АмплиПрайм® РИБО-преп ВЕТ» (ООО «НекстБио», г. Москва). Амплификацию выполняли на детектирующих термоциклерах Rotor-Gene Q (Qiaqen, Германия), CFX96 (Bio-Rad, США), QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США) и «ДТ Прайм» (ООО «ДНК-Технологии», Россия). Температурно-временной режим амплификации был следующим: 50 °С – 15 мин. (обратная транскрипция), 95 °С – 15 мин. (предварительная денатурация) и 45 циклов амплификации: 95 °С – 10 сек.; 60 °С – 20 сек.

Для определения повторяемости результатов исследований, получаемых с использованием разработанных наборов, проводили исследование 4 проб заведомо положительного патологического материала (пробы селезенки от естественно инфицированных свиней) одним исследователем в трех повторах на одном оборудовании (Rotor-Gene Q) в течение одного дня. Для определения внутрилабораторной воспроизводимости проводили исследование четырех проб заведомо положительного патологического материала (пробы селезенки от инфицированных свиней) в трех повторах двумя операторами в разные дни на разном оборудовании (Rotor-Gene Q и CFX96).

Результаты исследований и обсуждение

ПЦР-наборы «АмплиПрайм» характеризуются единым форматом исполнения: каждый набор включает в себя ПЦР-буфер В (содержит буферный раствор и Taq-ДНК-полимеразу), ПЦР-смесь (специфичная для каждого набора и включает в себя олигонуклеотидные праймеры и зонды, а также 5’ – дезоксирибонуклеозидтрифосфаты), отрицательный и положительный контроли ПЦР и ревертазу R (только в наборах для выявления РНК). Главными компонентами каждого набора, определяющими специфичность и чувствительность, являются олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентномеченые зонды, комплементарные консервативным участкам геномов выявляемых вирусов. Для амплификации и детекции геномов вирусов АЧС, КЧС, европейского и североамериканского генотипов вируса РРСС, ЦВС-2 и ЦВС-3 подобраны системы олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченых зондов, комплементарных фрагментам генов p72, 5’-UTR (5’ – нетранслируемый регион), ORF06 (открытая рамка считывания 06), ORF07 и Rep (репликазы) соответственно.

Для амплификации и детекции внутреннего контрольного образца ВКО В, добавляемого к исследуемым образцам патологического материала на стадии экстракции нуклеиновых кислот, в состав разработанных наборов включены дополнительные системы олигонуклеотидных праймеров – флуоресцентномеченых зондов. Образец ВКО В входит в состав наборов для экстракции нуклеиновых кислот «МагноПрайм ВЕТ» и «АмплиПрайм® РИБО-преп ВЕТ» и является универсальным, поскольку позволяет контролировать качество экстракции ДНК и РНК.

После подбора системы амплификации и оптимизации состава реакционных смесей разработанные ПЦР-наборы тестировались по таким показателям как аналитическая специфичность и чувствительность.

Аналитическую специфичность определяли при исследовании проб биоматериала, указанного в разделе «Материалы и методы». При этом показано, что наборы реагентов «АмплиПрайм® АЧС», «АмплиПрайм® КЧС», «АмплиПрайм® ЦВС-2/ЦВС-3»
и «АмплиПрайм® РРСС» специфически выявляют геномы вирусов АЧС, КЧС, ЦВС-2, ЦВС-3 и РРСС, соответственно. При работе с данными наборами не было получено ложноположительных и ложноотрицательных результатов, что свидетельствует об их высокой специфичности.

Аналитическую чувствительность разработанных наборов определяли, исследуя последовательные десятикратные разведения рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты геномов вирусов АЧС, КЧС, ЦВС-2/ЦВС-3, европейского и североамериканского генотипов вируса РРСС с известной исходной концентрацией. Было показано, что разработанные ПЦР-наборы обладают аналитической чувствительностью не ниже 1х103 копий ДНК/мл.

Ввиду высокой социально-экономической значимости АЧС, нами была проведена валидация набора «АмплиПрайм® АЧС» на базе ФГБУ «ЦНМВЛ» по таким критериям как повторяемость, внутрилабораторная воспроизводимость и специфичность. Получены высокие результаты повторяемости и внутрилабораторной воспроизводимости результатов исследования: коэффициент вариации (CV) в условиях повторяемости составил 1,2–1,7 %; коэффициент вариации (CV) в условиях внутрилабораторной воспроизводимости составил 3,6–6 %.

Исследование пищевой продукции на наличие генома вируса АЧС является в настоящее время актуальной задачей, поскольку это позволяет косвенно контролировать и оценивать эффективность мер по профилактике болезни и ликвидации очагов инфекции. Пригодность набора «АмплиПрайм® АЧС» для выявления генома вируса АЧС в пробах пищевой продукции оценивали, исследуя сырое мясо, полуфабрикаты и колбасные изделия, полученные от свиней, инфицированных вирусом АЧС. ДНК вируса АЧС выявили во всех образцах.

Заключение

Таким образом, нами разработана линейка наборов («АмплиПрайм® АЧС», «АмплиПрайм® КЧС», «АмплиПрайм® ЦВС-2/ЦВС-3», «АмплиПрайм® РРСС») для дифференциальной диагностики АЧС и инфекций со сходными клиническими признаками. Эти наборы при использовании в комплексе с наборами для экстракции нуклеиновых кислот «МагноПрайм ВЕТ» и «АмплиПрайм® РИБО-преп Вет» позволяют исследовать широкий спектр биоматериала. Проведенные исследования показали, что разработанные ПЦР-наборы обладают высокой аналитической чувствительностью и специфичностью. Кроме того, набор «АмплиПрайм® АЧС» позволяет выявлять геном вируса АЧС в пробах пищевой продукции, что является актуальной задачей при проведении противоэпизоотических мероприятий.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Алькрудо Д. Б., Ариас М., Гайардо К. и др. Африканская чума свиней: обнаружение и диагностика. Руководство для ветеринаров. Рим: ФАО, 2017; 104.
2. Газаев И. Х. Совершенствование методов индикации генома вируса африканской чумы свиней в объектах ветеринарного надзора: Дис. … канд. биол. наук. Покров, 2011; 134 с.
3. Савкина, Л. Итоги 2021 года: по объему производства лидирует мясо птицы, свинина дешевеет [Электронный ресурс]// Сельскохозяйственное обозрение «Ценовик». URL: https:// www.tsenovik.ru/articles/obzory-i-prognozy/itogi2021-goda-po-obemu proizvodstva-lidiruetmyaso-ptitsy-svinina-desheveet/ (дата обращения: 12.05.2022).
4. Эпидситуация по АЧС в Российской Федерации [Электронный ресурс]// Россельхознадзор. URL: https://fsvps.gov.ru/ru/iac/rf/achs (дата обращения: 12.05.2022).
5. African swine fever. EFSA Journal. 2015; 13(7): 4163.

Авторы:

НИКОЛАЙ ИГОРЕВИЧ САЛЬНИКОВ, к. б. н., специалист по разработке новой продукции, n.salnikov@nextbio.ru
МАРИЯ ЕВГЕНЬЕВНА СЕНИНА, директор научно-производственного комплекса ООО «НекстБио» (г. Москва)
ЗЕЛИХА СУЛТАНОВНА ДЕВРИШОВА, заведующая отделом
АНАСТАСИЯ СЕРГЕЕВНА ПРЕОБРАЖЕНСКАЯ, научный сотрудник
АЛИСА АЛЕКСЕЕВНА РАЗУМОВА, к. б. н., начальник отдела
ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория» (г. Москва)