Подход ВДЦ “Алекрис-консалтинг” к секвенированию изложен в статье “Филогенетический анализ изолятов вируса РРСС”, опубликованной в сборнике VII Научно-практической конференции “Ветеринария в свиноводстве” (2018 г.) Авторы статьи – Духовский А.В., Васильева Н. ., Брит Д.С. (ООО «Алекрис-консалтинг», Новосибирск), Кабилов М.Р., Тупикин А.Е. (ЦКП «Геномика» СО РАН, ИХБФМ СО РАН, Новосибирск). Здесь мы приводим выдержку из этой статьи.

Использование молекулярно-генетических методов диагностики в ветеринарии в последние годы вызывает все больший интерес в практическом свиноводстве. Однако наиболее распространённый метод ПЦР с детекцией в реальном времени, как правило, позволяет лишь диагностировать наличие заболевания. В случае же необходимости оценки филогенетического положения возбудителя инфекции и выяснения его происхождения используется секвенирование маркерных генов или даже полных геномов с помощью метода Сэнгера или высокопроизводительного секвенирования.

ВДЦ «Алекрис консалтинг» совместно с Центром коллективного пользования «Геномика» СО РАН проводит филогенетический анализ изолятов вируса РРСС по гену ORF7 с помощью секвенирования. После предварительного ПЦР скрининга и выявления положительных проб проводится обратная транскрипция, амплификация гена, реакция Сэнгера и анализ её продуктов на капиллярном секвенаторе. Полученные нуклеотидные последовательности выравниваются с сиквенсами из базы данных и методом максимального правдоподобия строится филогенетическое дерево, анализ которого позволяет сделать определенные выводы о положении и происхождении изолята РРСС. В качестве примера на рисунке представлено филогенетическое дерево с локализованными изолятами (черный цвет), отнесенных в результате анализа ко второму субтипу европейского генотипа вируса РРСС.

Секвенирование не только подтверждает специфичность ПЦР при диагностике заболевания, но и позволяет дифференцировать штаммы и изоляты вируса. Благодаря имеющейся базе данных европейского генотипа вируса РРСС, которая постоянно пополняется новыми российскими изолятами, систематические исследования такого типа дают возможность отслеживать происхождение вируса и его эволюцию.

Таким образом, использование филогенетического анализа позволяет:
– определять происхождение вируса;
– отслеживать его эволюцию;
– дифференцировать полевой штамм от вакцинного для хозяйств, использующих живую вакцину;
– использовать информацию о выделенных изолятах при создании более эффективных вакцин.