Комментарий Марселя Кабилова, руководителя ЦКП “Геномика” ИХБФМ СО РАН:
В ситуации, когда ПЦР получился, а секвенирование не прошло, нет никаких противоречий, и она не ставит вопрос о том, есть РРСС или его нет. Ставит другие вопросы, которые по большому счету хозяйство в большинстве случаев и не касаются.
Задачи секвенирования и ПЦР отличаются. RT-PCR должен ответить на вопрос: присутствует ли вирусная РНК в предоставленном образце? Для этого после обратной транскрипции проводится ПЦР в реальном времени, причем, как правило, идет амплификация весьма короткого ампликона (<100 п.о.), что, с одной стороны, обеспечивает высокую эффективность, а с другой, бывает полезно при использовании деградированной РНК.
В том случае, если ПЦР дал положительный результат, то можно ставить следующий вопрос: а какой генотип/субтип и какое происхождение данного изолята/штамма? Чтобы ответить на этот вопрос, необходимо уже знать нуклеотидную последовательность определенных генов, а лучше всего вирусного генома. Несмотря на значительное снижение стоимости полногеномного секвенирования, оно еще не вошло в практику при анализе вирусов в сельском хозяйстве. Чаще, но не намного, используется более бюджетное секвенирование методом Сэнгера генов ORF7 или ORF5, если речь о РРСС. Нуклеотидная последовательность гена позволяет определить генотип, субтип, а если хозяйство заказывает секвенирование постоянно, то отвечает на вопрос тот же ли это штамм, что был в прошлый раз, не пришел ли он из другого хозяйства или может быть он связан с вакцинированием (вряд ли конечно).
В секвенировании по Сэнгеру можно выделить 2 этапа, первый – проведение амплификации интересующего гена, и второй – непосредственно секвенирование ампликона. На каждом из этих этапов могут быть проблемы. Например, может не идти амплификация ПЦР-фрагмента (в отличие от RT-PCR он не короткий, а, как правило, >500 п.о.). Такое возможно по нескольким причинам, например, деградация выделенной РНК, низкая вирусная нагрузка, присутствие ингибиторов или несоответствие используемых праймеров к этому конкретному штамму вируса. Последнее возможно, т.к. геном вируса весьма эволюционно пластичен и его структура постоянно меняется. И не смотря на то, что праймеры выбираются на наиболее консервативные участки, такие изменения в перспективе 5-10 лет потенциально возможны.
Таким образом, если не удается наработать ампликон, то, естественно, нельзя провести и его секвенирование, что, как понятно, никак не влияет на вопрос, присутствует ППРС или нет. Если ПЦР-фрагмент нарабатывается, но секвенирование не идет, то в зависимости от результатов анализа реакции Сэнгера это может быть присутствие примесей, ингибирующих ферменты, или наличие, например, смеси двух изолятов, с отличающимися нуклеотидными последовательностями генов, что приводит к наложению сигналов и невозможности их разделения.